氢镁联合更肥美！

Ou C, Qiu X, Zhao Q, Ding D, Zhang Y, De J, Wang Y, Tang K, Yang H, Pan Q. Magnesium Plus Hydrogen Fertilization Enhances Mg Uptake, Growth Performance and Monoterpenoid Indole Alkaloid Biosynthesis in Catharanthus roseus. Plants (Basel). 2025 Oct 31;14(21):3336. 

1 引言

长春花（*Catharanthus roseus* (L.) G.Don）隶属于夹竹桃科（Apocynaceae），是一种富含生物碱的植物，可产生130多种单萜吲哚生物碱（MIAs），这些生物碱具有重要的药理活性[1]。其中，从长春花中提取的两种二聚吲哚生物碱——长春碱（vinblastine）和长春新碱（vincristine），因其抗癌作用而广为人知[2]。此外，长春花还能产生单体MIA，例如可用作抗高血压药的阿吗碱，以及可用作镇静剂的蛇根碱（serpentine）[1]。由于长春花植株中长春碱和长春新碱的含量极低，因此工业上主要通过其单体前体（文多灵和长春质碱）进行半合成，以实现这两种二聚MIA的商业化生产。因此，优化栽培策略对于提高长春花中具有药理价值的MIA产量至关重要。

施肥是保障作物产量的常用手段。已有研究表明，施加含大量元素或微量元素的肥料会影响长春花中生物碱的积累。例如，不同形态的氮素对长春花MIA产量的影响存在差异[3]；在UV-B辐射条件下同步供应高浓度硝酸盐，可提高长春质碱和文多灵的积累量，但UV-B胁迫会显著抑制长春花生长[4]；高浓度钾可有效调控MIA代谢，但会降低长春花生物量[5]；尿素肥料及基质可促进长春花中利血平（reserpine）的产生[6]；施氮肥可显著提高长春花突变体中的生物碱含量[7]；盐胁迫条件下，外源施加氯化钙（CaCl₂）可提高文多灵、长春质碱和长春碱的含量[8]；纳米铁肥可显著提高长春花的生长指标、光合色素含量及总蛋白含量[9]；叶面喷施100 ppm锌可有效提高文多灵含量[10]。此外，与完全营养处理相比，镁（Mg）缺乏会使长春花的阿吗碱浓度降低22%[11]。综上，这些研究表明，营养供应可调控MIA的生物合成，但往往需要以牺牲植株生长为代价。目前，关于氮（N）、钾（K）、钙（Ca）、锌（Zn）对长春花影响的研究已较为广泛，但针对镁肥应用的研究较少，而关于镁与氢协同作用的研究则尚未见报道。这一未被探索的领域正是本研究的创新点所在。

镁是植物必需的大量元素，参与光合作用、同化物的生成与分配[12]。镁可促进植物对氮的吸收与利用，施镁肥能提高作物籽粒产量及氮利用效率（NUE）[13,14,15]。此外，镁肥还会影响植物体内生物碱的代谢：施用硫酸镁（MgSO₄）和碳酸镁钙（CaMg(CO₃)₂）均可提高卡塔丁马铃薯（Katahdin potato）块茎中的总糖苷生物碱（TGA）含量[16]；当硫酸镁施用量为40磅/英亩时，马铃薯块茎中糖苷生物碱的积累量达到最高[17]；叶面喷施2%硫酸镁溶液也可对印度烟草（Indian tobacco）总生物碱的形成产生积极影响[18]；与对照组相比，施用硅钙钾镁肥可提高党参（*Codonopsis tangshen* Oliv.）中生物碱、多糖、黄酮及总蛋白的含量[19]。镁肥主要分为两类：（1）缓释镁肥（Mg-S），包括氧化镁（MgO）和氢氧化镁（Mg(OH)₂）；（2）速释镁肥（Mg-R），包括硫酸镁（MgSO₄）[20]。这些研究表明，施镁肥可影响多种植物的生物碱代谢。已有报道指出，镁缺乏会降低长春花的阿吗碱浓度[11]，但镁在长春花MIA合成中的具体作用仍不明确。

研究发现，氢气可不同程度地促进黑麦、绿豆和水稻的种子萌发[21]。此外，富氢水可影响植物激素合成、上调特定基因表达，并与信号分子相互作用，从而调控植物生长发育[22]。尤为重要的是，新证据表明，分子氢可直接调控植物次生代谢产物的生物合成。例如，已有研究证实，富氢水处理可显著上调药用植物掌叶榕（*Ficus hirta*）的苯丙烷类生物合成途径，提高黄酮类和香豆素类物质的含量[23]。氢化镁（MgH₂）是一种固态储氢材料，具有储氢量高（7.6 wt%）、成本低、资源丰富等特点，在工业、医药和农业领域具有潜在应用价值[24,25,26,27]。氢化镁水解时，1分子MgH₂可释放2分子氢气（H₂）；镁粉（MgP）在水中也会发生类似反应，但1分子镁粉仅释放1分子氢气。由于具备释氢能力，MgH₂和MgP可作为镁-氢复合肥使用。此外，最新研究表明，以MgH₂形式供应的镁-氢复合物可激活植物复杂的防御机制，例如通过氢介导的调控作用提高水稻对镉（Cd）的耐受性[28]。然而，这种协同作用在提高药用植物中高价值次生代谢产物合成方面的潜力尚未得到探索。

本研究选用四种镁浓度相同的肥料（MgO、MgSO₄、MgH₂、MgP），探究镁肥及镁-氢复合肥对长春花土壤pH值、镁吸收量、种子萌发、植株生长、MIA生物合成及基因表达的影响，旨在探索MgH₂和镁粉作为农业肥料的潜在应用价值。本研究假设，与传统镁肥相比，MgH₂和镁粉可通过同步供应镁和释放氢气，提高长春花对镁的吸收、促进植株生长并增强MIA的生物合成。鉴于目前关于氢气对植物次生代谢产物影响的研究较少，且尚未见镁-氢协同施用对药用植物影响的报道，评估二者对长春花生长及MIA产量的影响具有重要意义。

2 材料与方法

2.1 试验材料与处理

长春花种子（“太平洋樱桃红”品种，Pacific Cherry Red）购自中国苏州丽美园艺科技有限公司。种子在添加四种镁肥（MgSO₄、MgO、MgH₂、镁粉（MgP，粒径50 μm，纯度98%））的基质土中萌发，其中MgSO₄和MgO分别代表传统速释镁肥和缓释镁肥，MgH₂和MgP代表新型缓释镁-氢复合肥。四种镁肥处理组的镁浓度均为7 mg/kg土壤。种子萌发2周后，将幼苗从育苗盘移栽至花盆（每盆1株），并再次向土壤中施加上述四种镁肥。第二次施镁肥4周后，每个处理组采集20株幼苗。测量株高和重量后，取幼苗顶部三层叶片，在液氮中研磨成粉，于-80 °C冰箱中保存，用于后续分析；用于MIA含量测定的样品则冷冻干燥72 h。

试验在温室中进行，温度控制为25±2 °C。基质土由泥炭土和蛭石按体积比6:4混合而成。七水合硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）购自中国上海九鼎化工科技有限公司；氧化镁（MgO）购自中国上海迈瑞尔实验设备有限公司；MgH₂和镁粉由上海交通大学氢科学中心提供。对照组不施加任何镁肥。

2.2 种子出苗率测定

在塑料育苗盘中装入8 cm厚的基质土，并按上述方法施加四种镁肥。每个处理组设置3次重复，每个重复30粒种子。种子播种深度为1 cm，覆盖基质土后，每周浇水2 L。每日22:00统计出苗幼苗数量，当子叶出土时视为出苗。

播种后连续14天记录数据，计算出苗率及50%种子出苗时间（T₅₀%）。采用插值法计算50%种子出苗时间（精确到天的小数部分），计算公式如下： 

T₅₀% = T + (50% - X)/(Y - X) 

其中，T₅₀%为50%种子出苗时间，T为出苗率达到50%的前一天，X为T天的出苗率（%），Y为出苗率≥50%当天的出苗率（%）。

2.3 株高与重量测定

第二次施镁肥4周后，每个镁肥处理组的每个重复中随机选取5株幼苗，测定株高和鲜重（FW）。株高使用精度为0.5 mm的直尺测量；鲜重采用精度为0.0001 g的分析天平，按重复组批量测量。

2.4 叶绿素含量分析

将长春花叶片样品快速冷冻后，在液氮中研磨成粉。取0.1 g样品粉末，加入1 mL 80%丙酮缓冲液，在黑暗条件下放置5 min；随后以12,000 r/min的转速离心10 min，将上清液转移至2.0 mL离心管（EP管）中。沉淀用1 mL 80%丙酮缓冲液重悬，重复离心一次并收集上清液。合并两次上清液，经有机针式滤器过滤后，取200 μL滤液加入微孔板，使用微孔板扫描分光光度计（PowerWave XS，美国BIO-TEK仪器公司，佛蒙特州威努斯基市）测定吸光度。以80%丙酮缓冲液为空白对照，分别在663 nm和645 nm波长下测定上清液的吸光度。每个处理组设置3次重复。采用Arnon公式计算丙酮提取液中叶绿素a和叶绿素b的浓度： 

ρₐ = 12.72A₆₆₃ - 2.59A₆₄₅ （1）  

ρᵦ = 22.88A₆₄₅ - 4.67A₆₆₃ （2）  

其中，ρₐ为叶绿素a浓度，ρᵦ为叶绿素b浓度，A₆₆₃为663 nm波长下的吸光度，A₆₄₅为645 nm波长下的吸光度。

2.5 植株组织镁含量测定

精确称取0.1 g样品（精确至0.0001 g）置于50 mL离心管中，加入5 mL水浸润样品，随后加入2 mL硝酸和1 mL过氧化氢。先在80 °C下加热30 min，再在125 °C下加热2 h；冷却至室温后，将溶液转移至50 mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度并摇匀。样品预处理完成后，采用电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES，iCAP 7000，美国赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆市）测定叶片中的镁含量。消解容器为聚四氟乙烯（teflon）材质，测定时设置空白对照和标准品用于ICP-OES校准。

2.6 基于实时荧光定量PCR（qRT-PCR）的相对表达量分析

在实时荧光定量PCR（qRT-PCR）实验中，总RNA提取自-80 °C保存的叶片样品。参照制造商（日本大阪TaKaRa公司）提供的实验方案，使用DNase I去除RNA中的DNA污染。以寡聚胸苷酸（oligo (dT)）为引物，按照Prime Script™逆转录酶试剂（Prime Script™ Reverse Transcriptase Reagent）说明书的操作步骤，将500 ng RNA样品逆转录合成为cDNA。

qRT-PCR分析在Peltier Thermal Cycler PTC200（美国Bio-Rad公司）仪器上进行，以合成的cDNA为模板，采用基因特异性引物（见表S1）进行目标基因检测，其中单萜吲哚生物碱（MIA）生物合成相关基因的引物序列列于补充表S1（Supplementary Table S1）。PCR反应中使用SYBR Green荧光染料（SYBR Premix Ex Taq；TaKaRa公司）对双链DNA（dsDNA）的量进行定量分析。qRT-PCR的循环条件列于表S2（Table S2）。

采用相对阈值循环数（Ct值）法（参考《ABIPRISM700序列检测系统用户手册2版》，2001年更新；美国PerkinElmer/Applied Biosystems公司）估算反应体系中初始模板的量。