公牛精子也能被氢气保护
摘要：目的：研究冷冻保存以及氢气（H₂）对精子质量特性、精子的代谢、氧化和抗氧化指标的影响。将用BioXcell稀释液稀释的精子、冷冻保存后的精子以及经H₂处理后冷冻保存的精子作为对照组进行研究。对所有组别的精子定性指标、自由基反应强度、抗氧化酶活性以及三磷酸腺苷（ATP）浓度进行了检测。结果发现，经H₂处理后冷冻保存的精子中脂质过氧化作用减弱，抗氧化活性增强。研究表明，经H₂处理后冷冻保存的精子中，二烯共轭物、三烯共轭物、丙二醛的含量降低，超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶的活性增强。在H₂的作用下，氧化过程的减弱伴随着精子中ATP浓度的增加。解冻后，与未使用H₂的组相比，在H₂作用下精子活力得到了显著的保持。因此，H₂在淬灭活性氧方面效果显著，从而在冷冻保存过程中保护精子免受氧化应激的影响。H₂的这些特性在低温下保护了精子，并确保了解冻后精子仍能保持较高的功能活性。
引言
冷冻保存的目的是保存有活力的精子并提高繁殖效率（帕里齐等人，2023）。冷冻保存可使精子处于代谢静止状态，并在需要时使用（赫扎维赫等人，2018）。这种方法在动物育种中尤其有价值，因为它能有效利用具有高繁殖能力和遗传价值的种公畜，同时降低动物感染性传播疾病的风险（孙等人，2020）。
尽管冷冻保存有诸多益处，但仍有相当数量的精子由于与冷冻相关的因素而丧失了生育能力（塔鲁达尔等人，2015）。
精子的质膜是最易受到冷冻损伤的主要结构（高和克里斯特，2020）。膜脂中含有大量的多不饱和脂肪酸，极易发生氧化反应（马塔-坎普扎诺等人，2012）。线粒体膜同样会暴露于活性自由基中，导致ATP储备耗尽（马德亚等人，2021）。
到目前为止，抗氧化剂已广泛应用于冷冻保存领域（巴赫马里等人，2020；巴纳斯等人，2024）。然而，尽管冷冻保护剂种类繁多，其效果仍有限，细胞存活率仅为40%-50%（沃森，2000）。
一种新的技术解决方案是在研究中使用氢气（H₂）。H₂作为一种具有治疗和预防作用的抗氧化剂，可通过选择性地还原细胞内的强氧化剂，如羟基自由基（OH⁻）和过氧亚硝酸盐（ONOO⁻），对氧化应激发挥细胞保护作用（大泽等人，2007）。
本研究的目的：探究在改变冷冻保存精子质量特性的背景下，H₂对精子氧化和代谢潜力的影响。
材料与方法
选用15头3岁龄的健壮公牛。本研究依据《动物权利普遍宣言》中规定的原则进行，并得到了下诺夫哥罗德国立农业大学兽医系当地伦理委员会的批准（2020年4月27日第10号协议）。
用无菌的BioXcell培养基（法国）稀释精子。然后进行最终稀释、包装和平衡处理（在4°C下放置3-4小时）。采用开放式颗粒法进行冷冻。一个开放式颗粒的剂量符合俄罗斯国家标准GOST 26030-2015，为0.2毫升。将精子冷冻7.5分钟，使其温度降至-145°C，然后将装有样品的容器放入液氮（-196°C）中。经过7天的隔离期后，使用标准技术对开放式颗粒冷冻的精液进行解冻。
通过用生理盐水洗涤并离心的方法，将精子从精浆中分离出来。
为了研究H₂对公牛精子的影响，使用了用氢水稀释的“BioXcell”。
溶液中H₂的浓度范围为1.2-1.5毫克/升。使用“人造卫星-3”设备（中国）进行H₂饱和处理。
实验分为三组。第一组为用BioXcell稀释液稀释的原精液；第二组为冷冻保存后的精子；第三组为经H₂处理后冷冻保存的精子。
使用SFA-500和Biola AFS-500精子分析仪（俄罗斯）评估精子的定性参数，包括精子总浓度、总活力百分比和直线运动百分比。
通过测定丙二醛（MDA）、二烯共轭物（DC）、三烯共轭物（TC）、席夫碱（SB）的浓度以及抗氧化酶——超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶的活性，来确定精子中自由基反应的强度。采用分光光度法测定SOD（西罗塔等人，2016）和过氧化氢酶的活性（杰柳金娜等人，2020）。采用分光光度法测定氧化过程的浓度（丹尼洛娃等人，2020），通过与硫代巴比妥酸反应测定MDA浓度（杰柳金娜等人，2017），通过无机磷酸盐含量采用非酶法测定ATP浓度（杰柳金娜等人，2023）。
将获得的实验数据计算为平均值（M）和平均误差（SEM）。使用Statistica 6.0和Microsoft Excel应用软件包进行数据的比较分析。采用夏皮罗-威尔克检验法对分布类型的假设进行检验。使用参数统计方法（经邦费罗尼校正的t检验）研究统计规律。差异的统计学显著性水平设定为p < 0.05。
结果
本研究表明，原精液中精子活力为82.51 ± 5.95%（表1）。冷冻保存后，经检测有活力的精子占71.15 ± 4.34%，而在冷冻保存前用H₂处理后，有活力精子的数量恢复到了第一组的水平。
原精液中，有活力精子的平均数量为3576 ± 617万/剂量，冷冻保存后，有活力精子的平均数量为2735 ± 516万/剂量。原精液中直线往复运动精子的比例为37.81 ± 1.69%，冷冻保存后，该指标下降了9.36%，为34.27 ± 1.17%。
在精子稀释液中添加H₂并随后进行冷冻，改变了解冻后细胞的功能状态，提高了细胞的活力。因此，解冻后精子活力提高了12%（p < 0.05），精子平均速度提高了9%（p < 0.05）。与未使用H₂进行冷冻保存的情况相比，在H₂作用下直线往复运动精子的比例增加了6.27%（p < 0.05）（表1）。
对氧化代谢水平的研究表明，冷冻保存后的精子（第二组）氧化过程增强。与原精液样本（第一组）相比，DC和TC的含量分别高出67%和52%（p < 0.05）。第二组中丙二醛的含量比第一组高出30%（表2）。使用H₂后，MDA、DC和SB的含量恢复到了第一组的水平。
对精子抗氧化系统功能活性的研究表明，在冷冻保存液中添加H₂后（第三组），精子中SOD和过氧化氢酶的活性显著增强（表3）。与原精液精子（第一组）相比，SOD和过氧化氢酶的活性分别提高了42%和74%（p < 0.05）。冷冻保存后（第二组）精子中SOD活性增加了28%，这可能是对细胞内脂质过氧化过程加剧的一种补偿反应，因为这种酶是首先参与抗氧化防御过程的。
对精子能量状态的研究表明，冷冻保存后的精子中ATP浓度低于原精液精子，从0.79 ± 0.09微摩尔/升降至0.28 ± 0.05微摩尔/升（表4）。使用H₂的精子中ATP含量约为未使用氢进行冷冻保存的精子的两倍（p < 0.05）。
结果分析表明，在冷冻保存过程中使用H₂时，精子的氧化过程减弱，抗氧化活性增强。同时，在冷冻保存过程中使用H₂还能观察到精子中ATP浓度的增加以及精子生育能力的提高。
表1 氢气对精子生育能力参数的影响，（平均值±平均误差）